椎間盤退變的生物學研究成就及展望

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摘要:椎間盤退變（IDD）是脊柱退行性疾病的關鍵病理基礎，常引起腰痛、椎管狹窄，最終引起患者活動受限，行動喪失。闡明IDD的關鍵分子病理學機制并開發相應的生物治療手段對IDD防治具有重要意義。近年來，國內科研工作者在國家系列課題的資助、支持下，在IDD的發病機制、干預措施、組織工程學修復策略等多方向取得了重大突破，為臨床IDD防治提供新思路和新方法。

關鍵詞:椎間盤退變 生物學研究 成就及展望

腰痛發病率高，常見于各年齡段、經濟狀況人群。據統計，腰痛的終生患病率超過80%。在美國，每4個人中便有1人在過去3個月中經歷過至少一次長達24h的腰痛癥狀發作[1]。除引起疼痛、麻木、活動受限外，腰痛還嚴重影響患者的工作狀態和活動能力。研究表明，腰痛是因病請假最常見的原因，大于因糖尿病、高血壓、腫瘤、哮喘、呼吸系統疾病致病假數之和[2]，加重了患者個人和全社會的經濟、醫療負擔。據統計，2016年美國用于腰痛疾病治療及康復的相關費用超過了1345億美元，高于其他納入統計的153種疾病，居于疾病負擔榜榜首[3]。腰痛病因復雜：肌肉勞損，韌帶拉傷等多種因素均可引起腰痛。當下學界普遍認為椎間盤退變（intervertebraldiscdegeneration，IDD）是引發腰痛，尤其是慢性腰痛的關鍵病理學基礎[4-5]。椎間盤是連接相鄰椎體的“關節類”組織結構，由組織學基礎相異，生理功能不同的三個部分構成，分別是：位于中央的髓核（nucleuspulposus，NP），外周包繞的纖維環（annulusfibrosus，AF）以及上下覆蓋的軟骨終板（cartilaginousendplate，CEP）。NP位于椎間盤的中心位置，主要由數量上相對較少的NP細胞及其分泌的大量蛋白聚糖構成。健康的NP組織在大體上呈現為“透明的果凍樣”，是脊柱必不可少的“緩沖墊”，它可以吸收人體因重力或活動所產生的部分應力，同時將剩余應力均勻地傳導至AF，確保AF組織不會因局部所受應力過大而撕裂。AF位于椎間盤周緣部，是包繞NP組織的環狀、致密纖維樣組織。根據大體解剖相對位置差異，AF被分為內層和外層兩個部分。內層AF主要由軟骨樣AF細胞及其所分泌的大量Ⅱ型膠原蛋白構成，而外層AF則由纖維樣AF細胞及其分泌的大量Ⅰ型膠原蛋白構成。CEP是椎間盤上下端連接椎體和AF的一層透明樣、無血管的軟骨樣組織。CEP可以緩沖部分應力，并通過滲透作用，在椎體和椎間盤之間承擔物質交換任務。研究認為，遺傳[6]、衰老[7]、吸煙[8]、肥胖[9]、過度應力[10]等多種因素均可引起IDD。而在眾多非遺傳因素中，過度應力是IDD發生發展占據主導地位的重要誘因[11]。研究表明，錯誤的坐姿選擇[12]、過度勞力工作[13]均會顯著增高IDD的發生率。施加于脊柱的應力會由NP緩沖、均勻分散至AF。過度應力可降低NP細胞合成代謝、增加分解代謝，也可以直接導致NP細胞凋亡，進一步打破NP組織的合成、分解代謝平衡，蛋白聚糖含量降低，含水量降低，導致NP緩沖、分散應力能力下降。最終可能導致AF組織局部所受拉伸超過其力學極限并破裂，NP突出。當前臨床上對IDD及繼發的脊柱退行性疾病主要采取藥物止疼，緩解癥狀的姑息治療。此類姑息療法只能依賴于非甾體類抗炎藥達到止疼目的，同時輔以肌松藥、活血化瘀藥等改善患者麻木、僵硬的機體感受，根本無法延緩疾病進展。待病情隨時間進一步加重，出現椎管狹窄，神經根受壓嚴重等癥狀時，往往只能依賴手術進行減壓，同時進行必要的節段融合。這一“破壞性”的手術操作以椎體活動度為代價對脊柱進行穩定。但遺憾的是，大規模臨床隊列研究證實，脊柱固定術后鄰近節段會加速退變，患者必須接受翻修手術進一步延長固定節段，造成脊柱活動度進一步丟失，嚴重影響患者的正常工作和生活。因此，進一步闡明異常應力致NP細胞退變、凋亡的具體機制，并據此開發IDD的延緩疾病進程藥物，對IDD防治具有重要意義。近年來，國內科研工作者緊扣IDD這一重要臨床問題，在國家系列課題的資助、支持下，圍繞IDD的關鍵分子事件、生物學治療辦法，利用多組學聯合測序，譜系追蹤小鼠等技術手段在IDD的發病機制、干預措施、組織工程學修復策略等多方向取得了重大突破，為臨床IDD防治提供新思路和新方法。

1全面考察異常應力致IDD的發病機制

異常應力是IDD的獨立致病因素，在IDD的各類非遺傳致病因素中占據主導地位。椎間盤主要承受由椎體傳導的脊柱軸向壓應力，主要來源于人體上半身的重力和日常活動過程中維持脊柱穩定的椎旁肌肉的軸向收縮壓力。生理情況下，椎間盤所受壓力與姿勢選擇有關，直立時約有84%的壓縮應力會被傳導至椎間盤，而直坐時100%的壓縮應力都會被傳導至椎間盤[14]。特殊作業人群因長期坐姿等因素IDD，頸腰痛發病率高。細胞角蛋白分子家族作為重要的細胞骨架蛋白，對壓力、剪切力等多種力學信號敏感，參與組織生長發育、神經軸突生長、腫瘤侵襲等多種重要的生理病理學過程。國內多個課題組長期致力于異常應力致IDD的機制和干預研究。華中科技大學邵增務教授團隊通過人IDD組織、體內外壓力致IDD模型等揭示了異常應力下HIF1A在椎間盤內源性修復再生中的作用，闡明了異常應力下NP細胞中HIF1A蛋白通過增加自噬水平，抵御異常應力致NP細胞退和凋亡[15]。空軍軍醫大學西京醫院羅卓荊、楊柳教授課題組研究發現，角蛋白8（Keratin8，KRT8）在人椎間盤NP細胞特異性表達。進一步研究發現，NP細胞KRT8蛋白表達量與IDD程度成反比，NP退變程度越高，NP細胞中KRT8蛋白表達量越低[16]，體外加壓培養模型下，人原代NP細胞中的KRT8蛋白表達水平呈下降趨勢[17]。進一步研究表明：NP特異性Krt8敲除（Lepr-Cre;krt8fl/fl）加重異常應力致IDD表型，加重異常應力致IDD高度丟失。機制研究表明，異常通過RHOA蛋白激活蛋白激酶N（proteinkinaseN，PKN）磷酸化KRT8蛋白43位絲氨酸。大鼠尾椎加壓模型證明，過表達Krt8和敲低應力轉導通路關鍵激酶Pkn1/2均可緩解異常應力致IDD，敲低Pkn1/2是治療機會窗更廣的IDD潛在治療靶點。

2深入探究炎癥在IDD

發生發展中的關鍵作用研究表明，NP組織內增高的炎性反應和增多的炎性介質分泌是眾多不利因素致IDD的共同分子病理學基礎[18]。椎間盤衰老、退變過程中，多種不利因素誘導NP細胞分泌更多的促炎因子、趨化因子、蛋白酶等，這一表型被稱為細胞衰老相關分泌表型（senescence-associatedsecretoryphenotype，SASP）。由衰老NP細胞分泌的炎性物質誘導神經、血管長入椎間盤內[19]，正反饋加劇NP組織內炎性反應，促進炎性細胞浸潤[20]，加速NP基質降解，引起IDD。國內多個課題組針對炎癥致IDD的機制和干預展開了大量研究。上海交通大學醫學院趙杰教授團隊研究表明炎性因子誘導下NP細胞凋亡增加，NP細胞退變表型顯著，而circVMA21可以通過miR-200c-XIAP通路抑制炎性因子誘導下的NP細胞凋亡、退變[21]。炎性因子致細胞衰老是近期的研究熱點。華中科技大學楊操教授團隊研究表明在人IDD樣本及炎癥致NP細胞衰老、退變模型下，長鏈非編碼RNANORAD的m6A修飾水平顯著升高，進而導致其降解，減輕了其對PUMILIO蛋白的封閉作用，導致NP細胞衰老和IDD[22]。羅卓荊、楊柳教授課題組發現：炎性因子誘發NP細胞衰老，出現細胞周期阻滯的NP細胞數目顯著增加，NP細胞SASP表型顯著。同時，這一衰老過程伴隨著NP細胞KRT8蛋白水平顯著降低。KRT8蛋白是重要的細胞骨架蛋白，參與蛋白的胞內轉運過程。機制研究進一步表明，炎性因子誘導的KRT8蛋白水平降低通過減少E3泛素連接酶SMURF2入核，導致核骨架蛋白LMNA泛素化水平增高，總LMNA蛋白水平降低，誘發NP細胞核不穩定。同時發現炎癥因子誘導下，NP細胞miR-31a-3p、miR-384-5p、miR-582-5p表達顯著增高，且靶向降低Krt8mRNA水平，靶向miR-31a-3p、miR-384-5p、miR-582-5p有效延緩驗證誘導的NP細胞衰老、退變和凋亡。同時，團隊也發現，炎癥因子刺激下的NP細胞自噬流紊亂，NP細胞退變進展，小分子化合物槲皮素可以通過SIRT1通路改善炎癥誘導下的NP細胞自噬流紊亂，延緩IDD[23]。

3靶向異常線粒體功能防治IDD

NP細胞是維持NP基質穩態的主要執行者，其主要功能是分泌NP基質。合成代謝往往需要消耗大量能量，作為細胞的“能量工場”，線粒體對NP細胞的穩態維持起到了舉足輕重的作用[24]。人退變椎間盤和多種IDD模型中均可發現線粒體結構損害和功能降低[25]。蘇州大學鄒俊教授團隊對人IDDNP樣本進行單細胞測序，結果提示NP細胞線粒體功能障礙誘導NP細胞凋亡是IDD過程中的重要分子病理學事件[26]。羅卓荊、楊柳教授課題組研究表明，衰老致IDD模型中NP組織中早老蛋白Progerin水平增高，引起線粒體結構破壞及線粒體功能紊亂，細胞內ROS水平顯著增高，線粒體酶復合物活性降低，線粒體膜電位下降，最終導致NP細胞ATP產生降低。線粒體的融合和分裂對線粒體的功能維持至關重要。Progerin模型下NP細胞編碼線粒體融合相關的Opa1，Mfn1/2基因mRNA、蛋白水平顯著降低，而編碼線粒體分裂的Drp1基因顯著增高。表明Progerin致衰老模型下NP細胞線粒體動力學紊亂，線粒體分裂增加，融合降低，最終引起線粒體功能損傷。小分子化合物蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）可以部分消除衰老模型下NP細胞中累積的Progerin蛋白，降低衰老導致的DNA損傷，改善NP細胞線粒體功能，延緩IDD[27]。除功能外，線粒體在調節糖脂代謝[28]、胞內鈣離子水平[29]與細胞凋亡等多個關鍵的生命過程中均發揮重要作用。通過對大鼠尾椎加壓模型下NP組織進行4DLabelFree蛋白組學分析發現，線粒體蛋白SIRT5在加壓致IDD模型下顯著降低。臨床樣本也表明隨著人IDD加重，NP組織中SIRT5蛋白水平降低。應用Sirt5敲除小鼠和異常應力致小鼠IDD模型，實驗結果表明Sirt5敲除顯著加重LSI致小鼠IDD表型。線粒體蛋白SIRT5是目前已知的唯一具有去琥珀酰化修飾活性的酶，通過對線粒體代謝關鍵蛋白的琥珀酰化修飾調節，參與三羧酸循環、電子傳遞鏈、脂肪酸氧化及糖酵解等關鍵代謝途徑的調節[30]。機制研究表明，SIRT5通過其去琥珀酰化酶活性參與線粒體關鍵蛋白AIFM1琥珀酰化修飾水平調節。IDD中降低了的SIRT5水平導致AIFM1琥珀酰化修飾水平增加，破壞了AIFM1-CHCHD4復合體之間的相互作用，損害了該復合體的線粒體蛋白輸入功能，最終導致線粒體形態和功能受損[31]。SIRT3蛋白是重要的去乙酰化酶，主要在線粒體中發揮作用。楊操教授團隊研究發現晚期糖基化終末產物在人退變NP組織、NP細胞體外退變模型中累積，誘導NP細胞線粒體SIRT3蛋白功能障礙和NP細胞凋亡。恢復線粒體蛋白SIRT3表達量及功能是防治IDD的潛在生物學策略[32]。

4明確生物節律在椎間盤穩態維持中的重要地位

生物鐘是廣泛存在于生命體中的重要生理現象，生物鐘的正常運作對維持組織器官穩態至關重要，這一重要發現獲得2017年諾貝爾獎。生物鐘廣泛存在于所有組織器官中。中樞生物鐘位于下丘腦視交叉上核，感受光照刺激，并調控外周生物鐘。外周生物鐘除受到中樞調控外，也對外界刺激和局部微環境進行響應，進而引發組織細胞出現適應性或者病理性改變研究表明，生物鐘的紊亂可以誘發肥胖、腫瘤、關節炎等多種疾病[33]。有研究發現，護士人群中，晝夜顛倒者更容易發生IDD，出現下腰痛，這提示晝夜節律紊亂可能與IDD有關[34]。椎間盤是一種具有高度節律性的組織，經歷著每日的活動/休息所施加的周期性負荷，而異常應力負荷是導致IDD發生的重要因素。羅卓荊、楊柳教授團隊聯合英國曼徹斯特大學孟慶軍教授團隊，對149例退變程度不一的NP組織樣本進行線性回歸分析，發現隨著IDD程度的加重，生物鐘節律關鍵蛋白BMAL1陽性細胞的比例逐漸降低，證明BMAL1蛋白水平與人IDD程度呈負相關。隨后應用Per2::Luc報告小鼠的椎間盤器官培養的研究表明，異常應力載荷顯著推遲節律時相，顯著降低節律震蕩振幅。更大的異常載荷則會完全廢除椎間盤節律震蕩。椎間盤Bmal1敲除小鼠（Col2a1-Cre;bmal1fl/fl）出現自發性IDD表型[35]。除異常應力外，炎癥因子也是損害生物鐘節律震蕩的重要因素。團隊研究表明，炎癥因子處理顯著降低NP細胞中Bmal1的表達水平、損害Bmal1的節律性震蕩，進而損害鐘控基因Nrf2基因的表達水平。而小分子化合物SFN同樣可以部分恢復炎癥因子處理下異常的Bmal1節律震蕩，恢復鐘控基因Nrf2的表達水平，延緩IDD[36]。該項研究首次證實了炎癥對椎間盤節律穩態的破壞，并證明恢復椎間盤正常生物節律是潛在的IDD干預靶點，具有重大意義，被國際頂刊NatRevRheumatol雜志在“研究亮點”欄目專欄評述[37]。

5針對椎間盤各組分特點開展組織工程技術創新與應用

椎間盤由NP、AF、CEP三部分組成，各部分組織結構各異，且所處的生物、力學微環境也有較大差異。NP生理情況下便處于較高的靜水壓力之下，且該高壓環境對維持椎體高度至關重要。退變椎間盤基質降解，NP富集水分子的能力降低，NP內靜水壓力降低，無法維持正常的椎間盤高度，導致椎間盤塌陷，結構喪失。可注射水凝膠因可以模擬胞外基質結構為NP細胞提供支持和具有微創治療前景而被廣泛關注。針對上述問題，結合可注射水凝膠的特點，研究團隊以甘油分子與聚乙烯醇鏈之間多個氫鍵結構為基礎合成了甘油交聯PVA凝膠（GPG）。該凝膠具有高可注射性、高生物安全性并適用于椎間盤的機械微環境。體外細胞實驗表明，GPG可以顯著降低病理性靜態和動態機械壓力導致的NP細胞凋亡。大鼠針刺模型和NP切除模型進一步在體內證明注射GPG可以有效維持椎間盤高度、NP結構的完整性和相對含水量，具有巨大的轉化潛力[38]。由大體組織學分布區別和組織學構成差異，AF可以分為內外兩部分。外層AF主要由“纖維樣”細胞和Ⅰ型膠原纖維構成，內層AF由更加圓潤的“軟骨樣”細胞和Ⅱ型膠原纖維構成。在AF損傷的修復過程中，內層的軟骨樣基質往往因炎性肉芽的填充、機化而被纖維瘢痕替代，從而影響AF損傷的修復效果。同時，缺乏對AF細胞亞群的充分認知，也是限制AF組織學與細胞學精準重建的主要原因。基于上述研究空白，研究團隊通過單細胞測序詳細揭示了AF細胞的亞群分布，為AF重建提供了細胞學的重建設計藍圖。通過譜系示蹤技術，團隊進一步驗證了AF干細胞從位于AF與椎體邊緣過渡區的干細胞巢中向AF中遷移分化的路徑。該發現為AF細胞亞群提供了一種根據細胞功能與分化狀態的新命名方式，相比于單純依靠解剖位置命名AF細胞亞群更具特異性。基于以上單細胞解碼的AF細胞圖譜，團隊提出了誘導種子細胞雙向分化從而重建AF的纖維樣與軟骨樣基質的AF重建策略并在體驗證負載AF干細胞的該復合水凝膠可有效重建AF的纖維樣基質與軟骨樣基質，實現AF的內外層有效修復和重建[39]。

6IDD生物學研究展望

近年來，大量基礎及臨床轉化研究聚焦于IDD的病理改變基礎與生物醫學治療，學界對IDD的發生、發展以及治療的深刻理解達到了前所未有的高度[20,40-42]。當前絕大多數生物學研究都集中于對椎間盤細胞自身穩態的干預，通過挽救椎間盤細胞，恢復椎間盤基質代謝穩態，以期在退變早期扭轉IDD的發展趨勢，達到“早干預、早治療”的目的；隨著IDD進展，數目本就相對稀少的NP細胞進一步凋亡，正反饋加重NP微環境炎癥反應[11]，加劇IDD進程。在此階段，利用組織工程技術修復椎間盤成為了更加可行的治療措施。當下對IDD的生物學研究依然存在局限。一是對椎間盤各部分異質性沒有深刻的理解。椎間盤各部分發育來源不同：NP由脊索發育而來；CEP和AF由體節發育而來，不同的發育來源導致椎間盤各部分細胞組分復雜，至今學界對NP細胞的組成，轉歸依然存在較大爭議。體外研究中使用的原代細胞、細胞系也尚未產生公認的“金標準”。二是對椎間盤整體性的考慮欠缺。椎間盤雖然由三個不同的部分構成，但其功能的正常行使依賴于三部分的有機結合，椎間盤任何一部分的損害都將導致其功能無法正常行使。當下的絕大部分研究都只聚焦于單因素對椎間盤單個部分的影響、修復、重建，尚未突破到對椎間盤整體修復、重建的更高層次。未來對IDD機制、干預和修復的研究應當聚焦于以下幾個方面：①利用單細胞測序，時空轉錄組、蛋白組等技術詳細描繪椎間盤各組分的細胞特征、表達圖譜，深刻認識椎間盤細胞的異質性，分別鑒定、探究各細胞亞群的功能。②尋找、構建更加符合人體生物力學的IDD模型。IDD由多因素造成，應基于靈長類動物（或符合人體生物力學的其他大動物），在充分認識人IDD誘因復雜性的基礎上，構建多種自發的、非自發的IDD模型，用于藥物或治療辦法的評價。③IDD的生物學研究應當聚焦IDD的早期關鍵分子事件，達到早診斷、早干預、早治療的最終目的。④充分認識、理解椎間盤各部分和椎間盤整體的生物力學性質，針對椎間盤結構與功能特點優化材料組成設計，基于類器官培養技術，選用具有遺傳發育學基礎的種子細胞和生物誘導因子，結合生物3D嵌合式打印技術，實現椎間盤復雜結構的一體化精準重建。整體構建具有正確細胞表型，正確基質成分，合格生物力學性能，能進行生物體原位替換的椎間盤生物假體，最終實現椎間盤的生物重建，徹底攻克IDD這一臨床難題。

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作者:羅卓荊 楊柳 王迪 單位:空軍軍醫大學西京醫院骨科